食品中沙门氏菌核酸检测验证

检测项目

核酸提取性能：

• 提取效率：回收率≥95%(参照ISO22174:2005)
• 纯度检测：A260/A280比值1.8-2.0(如：A260/A280≥1.8)

PCR扩增验证：

• 灵敏度：检出限≤100CFU/g(GB/T4789.4-2016)
• 特异性：无假阳性/假阴性反应

定量检测参数：

• 定量限：LOQ≤10CFU/g
• 线性范围：10-10^6CFU/g

重复性与重现性：

• 批内变异系数：CV≤5%
• 批间变异系数：CV≤10%

准确性评估：

• 回收率：90-110%
• 偏差控制：相对偏差≤±15%

稳定性测试：

• 核酸储存稳定性：-20°C下≥6个月
• 试剂稳定性：室温下≥24小时

交叉污染控制：

• 阴性对照：无扩增信号
• 空白对照：背景噪声≤5%

基质效应分析：

• 抑制物评估：抑制率≤10%
• 干扰物测试：无显著干扰

引物探针验证：

• 溶解曲线分析：单一峰值
• 特异性测试：无非靶序列扩增

数据分析参数：

• Ct值阈值：Ct≤35
• 扩增曲线斜率：≥-3.5

检测范围

1.生鲜肉类：包括鸡肉、牛肉等，重点检测高脂肪基质对核酸提取的影响。

2.乳制品：牛奶、奶酪等，检测高蛋白成分的干扰效应。

3.水产品：鱼虾、贝类等，侧重高水分基质中的检测灵敏度。

4.蔬菜水果：沙拉、鲜切产品等，评估植物源抑制物影响。

5.加工食品：罐头、速冻食品等，重点检测加工残留物干扰。

6.调味品：酱油、醋等，检测酸性或碱性环境的稳定性。

7.婴儿食品：配方奶粉、辅食等，侧重严格限量标准下的准确性。

8.烘焙食品：面包、蛋糕等，评估发酵产物对PCR扩增的影响。

9.饮料：果汁、矿泉水等，检测液体稀释对定量限的影响。

10.宠物食品：干粮、湿粮等，评估综合基质效应下的可靠性。

检测方法

国际标准：

• ISO22174:2005Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-Polymerasechainreaction(PCR)forthedetectionoffood-bornepathogens-Generalrequirementsanddefinitions
• ISO/TS15216-1:2017Microbiologyofthefoodchain-HorizontalmethodfordeterminationofhepatitisAvirusandnorovirususingreal-timeRT-PCR-Part1:Methodforquantification

国家标准：

• GB/T4789.4-2016食品微生物学检验沙门氏菌检验
• GB/T34792-2017食品中致病菌核酸定量检测方法PCR法

检测设备

1.实时荧光定量PCR仪：ABI7500型号(检测通道≥4，温度精度±0.1°C)

2.离心机：Eppendorf5424型号(转速范围500-15000rpm，容量1.5-50ml)

3.分光光度计：NanoDrop2000型号(波长范围190-840nm，检测限0.2ng/μl)

4.核酸提取仪：QiagenQIAcube型号(提取效率≥95%，处理量24样本/批次)

5.电泳系统：Bio-RadMini-PROTEAN型号(电压范围50-300V，凝胶尺寸10x10cm)

6.恒温水浴锅：MemmertWNB14型号(温度范围室温-100°C，精度±0.1°C)

7.移液器：GilsonPipetman型号(精度±0.5%，体积范围0.1-1000μl)

8.生物安全柜：ESCOClassII型号(气流速度0.5m/s，过滤效率99.995%)

9.培养箱：BinderKB53型号(温度范围5-50°C，湿度控制±5%)

10.低温冰箱：HaierDW-86L388型号(温度范围-40°C至-10°C，容量300L)

11.振荡器：IKAKS130型号(转速100-1500rpm，振幅3mm)

12.显微镜：OlympusCX23型号(放大倍数40-1000x，分辨率0.2μm)

13.高压灭菌器：Tuttnauer3870EA型号(温度121°C，压力15psi，容量75L)

14.数据分析软件：AppliedBiosystemsSDS型号(数据处理算法，兼容实时PCR数据)

15.样品粉碎机：IKAA11型号(转速20000rpm，处理量100g/批次)

北检(北京)检测技术研究院【简称：北检院】