AAV衣壳蛋白纯度分析

检测项目

纯度分析：

• 总蛋白纯度：百分比纯度≥95%(参照USP<905>)
• 空壳率检测：空壳占比≤20%(A260/A280比值1.0-1.3)
• 聚集体分析：聚集体含量≤5%(SEC-HPLC峰面积积分)

杂质检测：

• 宿主细胞蛋白残留：HCP≤100ng/mg(ELISA法，灵敏度1ng/mL)
• DNA残留：dsDNA≤10ng/mg(PicoGreen荧光检测，检测限0.5ng/mL)
• 内毒素水平：内毒素≤5EU/mL(LAL试验，参照USP<85>)

结构完整性：

• 衣壳完整性：完整衣壳比例≥80%(透射电镜成像)
• 肽图分析：酶解片段匹配度≥90%(LC-MS/MS序列覆盖)
• 二硫键稳定性：自由巯基≤2/mol(Ellman试剂法)

浓度测定：

• 蛋白浓度：UV280测定，误差±5%(extinctioncoefficient1.0cm⁻¹mg⁻¹mL)
• 病毒滴度：基因组拷贝数≥1E12vg/mL(qPCR法，引物特异性验证)
• 颗粒浓度：A260测定，变异系数≤10%(Nanodrop校准)

生物活性：

• 感染性滴度：TCID50≥1E8IU/mL(细胞培养assay)
• 受体结合能力：KD值≤10nM(SPR表面等离子共振)
• 转基因表达效率：荧光蛋白表达≥70%(流式细胞术)

物理性质：

• 粒径分布：Z-average直径20-25nm(动态光散射，PDI≤0.2)
• zeta电位：表面电荷-10to-20mV(激光多普勒电泳)
• 热稳定性：Tm值≥60℃(差示扫描量热法)

化学性质：

• 氨基酸组成：偏差≤5%(酸水解-HPLC)
• 糖基化修饰：中性糖含量≤1%(HPAEC-PAD色谱)
• 氧化程度：Met氧化≤10%(质谱定量)

微生物检测：

• 无菌测试：无微生物生长(膜过滤法，参照USP<71>)
• 支原体检测：PCR阴性(引物扩增mycoplasma基因)
• 生物负荷：CFU≤10/g(平板计数法)

稳定性测试：

• 加速稳定性：40°C/75%RH下纯度变化≤5%(ICHQ1A指导)
• 冻融循环：效价损失≤10%(3次循环验证)
• 长期稳定性：-80°C储存12个月无降解(实时监测)

功能assay：

• 体内分布：靶组织富集≥80%(活体成像)
• 免疫原性：抗AAV抗体滴度≤1:100(ELISA血清检测)
• 基因编辑效率：indel率≥50%(NGS测序分析)

检测范围

1.AAV血清型1-9：涵盖AAV1至AAV9不同血清型衣壳蛋白，重点检测血清型特异性纯度和空壳率变异。

2.临床级AAV制剂：GMP条件下生产的基因治疗产品，侧重杂质残留、无菌性和稳定性合规检测。

3.研究级AAV样品：实验室规模制备的病毒载体，检测重点为基本纯度、浓度和感染性验证。

4.空壳衣壳对照品：纯化空壳蛋白标准品，用于方法开发和质量控制，聚焦空壳率准确量化。

5.部分填充衣壳：不完全基因组包装的衣壳，分析重点为填充效率与完整性关联参数。

6.突变体衣壳蛋白：工程化改造的AAV变体，检测涉及结构稳定性、受体亲和力变化。

7.冻干AAV制剂：lyophilized形式产品，侧重复溶后效价、聚集度和水分残留分析。

8.组合疗法AAV：与其它载体或佐剂混合的样品，检测兼容性、杂质交叉污染。

9.组织特异性AAV：靶向特定器官的衣壳，重点评估组织嗜性验证和脱靶效应。

10.大规模生产中间体：纯化过程中的洗脱液或浓缩样，监控步骤相关杂质和收率。

检测方法

国际标准：

• USP<905>色谱纯度测定法(反相HPLC和SEC-HPLC方法)
• ISO10993-18生物材料化学表征(用于杂质谱分析)
• EP2.6.21病毒载体滴度测定(qPCR标准程序)
• ICHQ6B生物技术产品规格(纯度、杂质接受标准)
• FDAGuidanceforIndustryAAVVectorCharacterization(全面质控框架)

国家标准：

• GB/T37871-2019基因治疗载体质量要求(衣壳蛋白纯度和安全性检测)
• GB/T19186-2017病毒载体制备规范(包括纯度分析方法和参数)
• GB/T33475-2016生物制品杂质检测通则(宿主蛋白和DNA残留限值)
• GB/T35823-2018无菌检测膜过滤法(微生物控制标准)
• GB/T37872-2019生物活性测定方法(感染性滴度assay)

方法差异说明：国际标准如USP侧重色谱方法细节，而GB标准整合更多安全性指标；ISO和EP在杂质检测上要求更严格限值，GB标准针对国内生产优化了样品处理流程。

检测设备

1.高效液相色谱系统：Agilent1260InfinityII(四元泵，二极管阵列检测器，波长范围190-600nm)

2.毛细管电泳仪：BeckmanPA800Plus(电场强度30kV，激光诱导荧光检测)

3.质谱仪：ThermoQExactiveHF-X(分辨率240,000，质量精度<1ppm)

4.动态光散射仪：MalvernZetasizerNanoZS(粒径范围0.3nm-10μm，温度控制4-90°C)

5.紫外可见分光光度计：ShimadzuUV-1900i(带宽1nm，波长准确性±0.3nm)

6.酶标仪：BioTekSynergyH1(双模式检测，荧光和吸光度线性范围0-4OD)

7.流式细胞仪：BDFACSymphonyA5(20参数检测，灵敏度<100MESF)

8.实时PCR系统：AppliedBiosystemsQuantStudio7(384孔板，荧光通道5个)

9.透射电子显微镜：JEOLJEM-1400Flash(分辨率0.2nm，加速电压80-120kV)

10.差示扫描量热仪：TAInstrumentsDSC250(温度范围-90°Cto550°C，灵敏度0.2μW)

11.表面等离子共振仪：Biacore8K(检测限0.1RU，流速范围1-100μL/min)

12.纳米颗粒跟踪分析仪：MalvernNanoSightNS300(浓度范围10^6-10^9particles/mL)

13.凝胶成像系统：Bio-RadChemiDocMP(CCD相机，像素密度4.2MP)

14.无菌测试隔离器：GetingeBSS-2(HEPA过滤，环境级别A)

15.低温离心机：Eppendorf5430R(最大转速15,000rpm，温度控制-20°Cto40°C)

北检(北京)检测技术研究院【简称：北检院】

报告：可出具第三方检测报告(电子版/纸质版)。

检测周期：7~15工作日，可加急。

资质：旗下实验室可出具CMA/资质报告。

标准测试：严格按国标/行标/企标/国际标准检测。

非标测试：支持定制化试验方案。

售后：报告终身可查，工程师1v1服务。

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注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试，望谅解（高校、研究所等性质的个人除外）。

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试验流程

1、与工程师沟通，确定具体的试验方案，我方报价；

2、双方签订委托书，我方接收样品；

3、进行细节沟通，我方进行试验测试；

4、试验测试完成，出具检测测试报告；

5、委托完成，我方提供售后服务。

检测仪器(部分)

合作客户(部分)

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